دانلود پایان نامه

فیزیکی ژن ها روی کروموزوم ها در اختیار داشتن کتابخانه های با قطعات بزرگ و سپس جستجو درون قطعات برای توالی های ژن مورد نظر ضروری است. کتابخانه های BAC حاوی قطعات بزرگ ژنومی می توانند به عنوان اتصال دهنده بین نقشه های ژنتیکی و فیزیکی استفاده شوند. در مطالعات ابتدایی FISH از قطعات کوچک DNA ژنومی (bp 1000-100) کلون شده در پلاسمید ها در هیبرید سازی در محل رادیواکتیو (RISH) استفاده شد (چادهاری و همکاران، 1998). RISH با توسعه تکنیکهای هیبریداسیون در محل غیر رادیواکتیو و پروب های حاوی قطعات بزرگ DNA به فراموشی سپرده شد. در این زمینه سه کلاس از پروبهای DNA تولید و استفاده میشوند:
1. پروب های حامل قطعات کوچک (Kb 40-20 ): کلونهای کاسمید (گوستاوسون، 1980) یا لامبدا.
2. پروب های حامل قطعات بزرگ (Kb 150-120): کلونهای BAC یا PAC.
3. پروب های حامل قطعات بسیار بزرگ (Mb 2-1): کلونهای YAC.
در حال حاضر کلونهای YAC به دلیل کارایی پایین کلونینیگ و درصد بالای کیمریسم (تا 50%) مورد استفاده قرار نمی گیرند (روبس و همکاران، 2009). تاکنون کتابخانه های ژنومی حاوی قطعات بزرگ برای گونه های اهلی از قبیل YAC (بروم و هیل، 1994؛ آلکساندر و همکاران، 1997؛ روجل گیلارد و همکاران، 1997 و هیل و همکاران، 1999 ) و BAC (کای و همکاران، 1995؛ ژو و همکاران، 1999؛ شیبلر و همکاران، 2004؛ ویمن و همکارانف 1999؛ روجل گیلارد و همکاران، 1999؛ بویتکمپ و همکاران، 2000؛ ایگن و همکاران، 2001؛ لیو و همکاران، 2012 و استافوزا و همکاران، 2012) تهیه شده اند.

1-2-11 ایمونوفلوروسنس
تکنیکهای ایمونوفلوروسنس را میتوان در نمونههای تازه یا ثابت شده استفاده کرد. در تکنیکهای ایمونوفلوروسنس، آنتی بادیها به صورت شیمیایی به رنگهای فلورسنت از قبیل FITC (فلورسین ایزوتیوسیانات) یا TRITC (تترا متیل رود امین ایزوتیوسیانات) متصل میشوند. آنتی بادیهای نشاندار شده به صورت مستقیم یا غیر مستقیم به آنتی ژن مورد نظر متصل شده و امکان ردیابی آنتی ژن را با تکنیکهای فلورسنس فراهم میآورند. میتوان فلورسنس را با استفاده از فلوسیتومتر، array scanner و یا با استفاده از میکروسکوپهای فلورسنس یا کنفوکال ردیابی کرد. دو روش اصلی ایمونوفلوروسنس به صورت مستقیم و غیر مستقیم میباشند. در روش کم کاربردتر ایمونوفلوروسنس مستقیم، آنتی بادی ضد مولکول مورد نظر به صورت شیمیایی به یک رنگ فلورسنت متصل می شود اما در روش ایمونوفلوروسنس غیر مستقیم، آنتی بادی ضد مولکول مورد نظر (آنتی بادی اولیه) غیر نشاندار است و آنتی بادی ثانویه (آنتی-ایمونوگلوبولین) نشاندار شده با یک رنگ فلورسنت به ناحیه پایدار در آنتی بادی اولیه متصل میشود (شکل 2-1).

شکل 2-1. مقایسه ایمونوفلوروسنس مستقیم و غیر مستقیم

مزیت اصلی ایمونوفلوروسنس غیر مستقیم این است که در این روش سیگنالها تکثیر یافته و قوی تر می شوند زیرا بیش از یک آنتی بادی ثانویه به هر آنتی بادی اولیه میچسبند. عیب اصلی ایمونوفلوروسنس غیر مستقیم نیز می تواند تولید زیاد سیگنالهای زمینه ای باشد (کومار و رودبک، 2009).

1-2-12 ویژگی های متافاز ها و نقشه های سیتوژنتیک خانواده گاو سانان
1-2-12-1 آتوزوم ها و نقشه های سیتوژنتیک
از آنجائیکه بازوهای آتوزومی بین گونه های گاو سانان حفظ شده اند و همچنین به دلیل شباهت بسیار زیاد کاریوتایپ های گاو و بز به کاریوتایپ گونه های اجدا گاو سانان، از کایوتایپ گاو و بز به عنوان مرجع برای شناسایی آتوزوم های همه اعضای خانواده گاو سانان استفاده می شود (گالاقر و وومک، 1984). گاو و بز دارای عدد دیپلوئید 60=n2 و آتوزوم های شبیه به هم هستند (فقط با اندکی تفاوت در BTA/CHI9 و BTA/CHI 14). به طوریکه یک قطعه کروموزومی از قسمت پروکسیمال BTA9 به CHI14 جابجا شده است. این جابجایی با هر دو روش آنالیز لینکاژ (دی گوراتی و همکاران، 1998) و مکان یابی با FISH (یانوزی و همکاران، 2001) تایید شده است. CHI 14 حاوی یک قطعه کوچک از BTA9 q11-q13 شامل COL9A1 و ETH225 است که به خوبی وجود جابجایی 9 به 14 را تایید می کند (بوکلند و ایوانس، 1978). نقشه یابی مقایسه ای بین گاو و بز با استفاده از FISH و توالی ژنومی گاو تفاوت های زیادی را بین کروموزوم های این دو گونه نشان نمی دهد (شیبلر و همکاران، 2009). در سال 1998، با استناد به ایده نقشه یابی مقایسه ای، اولین نقشه سیتوژنتیک مقایسه ای در حیوانات اهلی، برای بز، با استفاده از کتابخانه کروموزوم مصنوعی باکتریایی و با کاربرد تکنیک FISH توسط شیبلر و همکاران تهیه شد. بنابراین می توان ادعا کرد که اولین نقشه مقایسه ای کامل برای نشخوار کنندگان برای بز توسعه یافته است. در این نقشه تعداد 202 ژن و 124 نشانگر ریز ماهواره ای در بز مکان یابی شدند. همچنین تعداد 103 قطعه شکست تکاملی با میانگین اندازه 27 سانتی مورگان برای نواحی حفظ شده بین ژنوم انسان و بز شناسایی شدند. با تکمیل شدن این نقشه تعداد جایگاه های ژنی نقشه یابی شده با FISH در آن زمان تا پنج برابر افزایش یافت. در نقشه یاد شده دو گروه ژنی دارای ترتیب یکسان (Synteny region) یافت شد که در آن ها تعداد 107 قطعه با ترتیب ژنی حفظ شده وجود داشتند (شیبلر و همکاران، 1998). بعدها، اولین نقشه ژنومی بز در چندین مطالعه سیتوژنتیکی دیگر در گونه های نشخوارکننده، مخصوصاً در بررسی کروموزوم های جنسی توسعه بیشتری یافت (روبینسون و همکاران، 1998؛ چاوز و همکاران، 2005؛ دیمئو و همکاران، 2005؛ بوگنو و همکاران، 2008 و یانوزی و همکاران، 2009).
شیبلر و همکاران (2009) یک نقشه سیتوژنتیک جدید را در بز بر اساس داده های حاصل از پژوهش های مختلف با تکنیک
FISH تهیه کردند. این نقشه 268 ژن و 144 نشانگر ریز ماهواره ای را شامل می شود. همچنین در این نقشه نواحی انسانی و گاوی مشابه با تمامی 412 لوکوس شناسایی شده در بز، نشان داده شده اند. لوکوس های شناسایی شده در این نقشه تقریباً 65 درصد نوارهای کروموزومی بز را پوشش می دهند. با در نظر گرفتن قطعات دارای ترتیب ژنی یکسان، می توان 59 قطعه حفظ شده را در این نقشه پیدا کرد که با یافته های پیشین برای گوسفند و گاو در توافق است. از طرفی دیگر بر اساس ترتیب ژنی می توان 140 قطعه حفظ شده را در این نقشه ردیابی نمود. این قطعات حفظ شده که به طور میانگین حدود 90 درصد از نوارهای کروموزومی بز را پوشش می دهند، از 100 درصد (در کروموزوم های 13 و 25) تا 50 درصد (در کروموزوم 28) متغییر هستند. نقشه سیتوژنتیک سال 2009 بز اولین و یکپارچه ترین نقشه مقایسه ای نشخوار کنندگان بود. مطالعه ژنوم بز سطح بالایی از همولوژی را در سطح باندهای کروموزومی با سایر نشخوار کنندگان نشان می دهد. به همین دلیل توجه به گوسفند و گاو به عنوان مدل های برجسته تر باعث کاهش مطالعات ژنومی در بز طی دهه های اخیر شده است.
اتصال مرکزی یا همان جابجایی روبرتسونی در حیوانات اهلی را می توان در گاو میش و گوسفند مشاهده نمود. این کروموزوم های دو بازویی، هم از نظر همولوژی بازوها و هم از نظر گروه های سینتنیک در مقایسه با گاو و بز بدون تغییر باقی مانده اند. دو گونه شناخته شده گاو میش در جهان وجود دارد که عبارتند از گاو میش آفریقای (Syncerus caffer) و گاو میش آسیایی (Babulus bubalis). گاو میش آفریقایی دارای دو زیر گونه به ترتیب با سه (Syncerus caffer caffer) (2n=52 , FN=60) و چهار (Syncerus caffer nanus) (2n=54 , FN=60) کروموزوم دو بازویی حاصل از ترانسلوکاسیون روبرتسونی کروموزوم های 13/1، 3/2، 20/5 و 13/1، 3/2، 20/5 و 29/11هستند (گالاقر و وومک، 1992). گاو میش آسیایی (BBU) دارای دو گونه اهلی بوبالوس بوبالیس (Bubalus bubalis) و بوبالوس میندورنسیس (Bubalus mindorensis) است. گونه بوبالوس بوبالیس دارای دو زیر گونه یا تیپ گاو میش رودخانه ای (2n=50, FN=60) و گاو میش باتلاتق (2n=48, FN=58) می باشد.
در گاومیش رودخانه ای پنج جفت کروموزوم (آتوزوم های 1 تا 5) دو بازویی منشا گرفته از پنج ترانسلوکاسیون روبرتسونی بین ده کروموزوم همولوگ گاو (گاو سانان اجداد) با توجه به استاندارد های کروموزومی گاو سانان (CSKBB، 1994؛ یانوزی، 1994 و ISCNDB، 2000) مشاهده می شوند که به ترتیب حاصل ترانسلوکاسیون روبرتسونی کروموزوم های 27/1، 23/2، 19/8، 28/5 و 29/16 گاو هستند. تفاوت گاومیش های تیپ رودخانه ای و باتلاقی در مورد یک جفت کروموزوم (و FN حاصل از آن) است به طوریکه ترانسلوکاسیون ترکیب پشت سر هم بین کروموزوم های 4 و 9 گاو میش رودخانه ای (تلومر BBU4q و سانترومر BBU9) باعث تولید کروموزوم شماره یک گاومیش باتلاقی شده اند (دی براردینو و یانوزی، 1981). هیبرید بین این دو گونه (گاومیش کارابائو) بارور است اما از آنجائیکه 49 کروموزوم دارد دارای نرخ باروری پایینی است. آنالیز توالی D-لوپ میتوکندریایی در 80 گاومیش (19 گاومیش باتلاق و 61 گاومیش رودخانه ای) اهلی شدن این حیوان را در 5000 سال پیش در هندوستان نشان داد (کیرستین و همکاران، 2004).
مکان یابی نشانگرهای نوع یک و نوع دو در گاومیش با استفاده از تکنیک FISH (یانوزی، 1998 و یانوزی و همکاران، 2003) انجام شده است. اولین نقشه ژنتیکی برای گاومیش رودخانه ای فقط با 57 جایگاه که عمدتاً با تکنیک FISH مکان یابی شده بودند، توسط یانوزی (1998) گزارش شد. در این نقشه حداقل یک نشانگر مولکولی گاوی روی هر یک از کروموزوم یا بازوهای کروموزومی گاومیش مکان یابی شدند. نقشه های سیتوژنتیکی پیشرفته تر با تعداد 99 (ال ناهاس و همکاران، 2009) و 293 جایگاه (یانوزی و همکاران، 2003) نیز بعدها تهیه شد. نقشه اخیر شامل 171 نشانگر نوع یک و 122 نشانگر نوع دو (عمدتاًٌ ریزماهواره ها) بود. از تعداد 293 نشانگر مکان یابی شده در نقشه اخیر تعداد 247 نشانگر با تکنیک FISH مکان یابی شدند. تعداد کل جایگاه های مکان یابی شده در گاومیش رودخانه ای تا سال 2009، 309 بود که شامل 186 نشانگر نوع یک و 124 نشانگر نوع دو می باشند. علی رقم تهیه نقشه سیتوژنتیکی برای گاومیش رودخانه ای، فقدان نقشه لینکاژی در این گونه احساس می شود. اخیراً نقشه های RH نیز برای تعدادی از کروموزوم های گاومیش توسعه یافته اند (آمارال و همکاران، 2007 و استافوزا و همکاران، 2007). عمدتاً نقشه های متراکم برای BBU1p ، BBU2q، BBU3p، BBU6prox، BBU8dist، BBU14، BBU15prox، BBU16، BBU18، BBU20، BBU-X و BBU-Ydist تهیه شده اند. برای ردیابی قطعات کروموزومی و سینتنیک های حفظ شده، مطالعات نقشه یابی مقایسه ای بین گاومیش رودخانه ای و سایر گونه های نزدیک به آن (گاو، گوسفند و بز) و انسان انجام شد. این مطالعات سطوح بالای همولوژی را بین بازوهای کروموزوم های آتوزومی گاوسانان نشان داد. در حقیقت، الگوهای مشابه باندینگ کروموزومی و ترتیب ژنی بین همه آتوزوم ها (یا بازوهای کروموزومی) برای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز تاکنون گزارش شده اند (دیمئو و همکاران،2000؛ یانوزی و همکاران، b و a2000؛ یانوزی و همکاران، 2001، دیمئو و همکاران، 2002 و 2005). همانگونه که قبلاً ذکر شد، تنها استثنا بین کروموزوم های 9 و 14 بوینه (گاو و گاومیش) و کاپرینه (گوسفند و بز) وجود دارد که در آن یک جابجایی/ معکوس شدگی یک قطعه پری سانتریک از BTA9 به CHI14 مشاهده می شود. مقایسه BTA9 با HSA9 قطعات حفظ شده بیشتری را نسبت به مقایسه CHI9 و HSA6q نشان داد (یانوزی و همکاران 2001). بنابراین کاریوتایپ بز مشتقی از کاریوتایپ اجدادی گاو است.
سازماندهی کروموزومی گوسفند و گاو درج
ه زیادی از حفظ شدگی را نشان می دهد که تا کنون با روش های مختلفی از جمله آنالیزهای سیتوژنتیک (انصاری و همکاران، 1993) و اخیرا مقایسات توالی های DNA در مقیاس بزرگ (دالریمپل و همکاران، 2007) تائید شده اند. گوسفند( 2n=54) دارای 26 جفت آتوزوم شامل 3 جفت کروموزوم ساب متاسانتریک و 23 جفت کروموزوم آکروسانتریک است. در مقابل گاو و بز هر دو دارای 29 جفت آتوزوم آکروسانتریک هستند. گوسفند و بز دارای کروموزوم های جنسی

Leave a Reply