و محاسبه غلظت نسبی، DNA استخراج شده همراه نشانگر وزن مولکولی (SM0331, Fermentase) و DNA فاژ لامبدا روی ژل آگارز 8/0 درصد الکتروفورز شدند.

جدول 3-4. ترکیبات محلول های P1، P2 و P3 استفاده شده در استخراج DNA
محلول
ترکیبات
P1
P2
P3
1
50 mM Tris, PH 8
0.2 N NaOH
3M KOAc (C2H3KO2)
2
10 mM EDTA
1% SDS

3
100 µg/ml RNase


SDS: sodium dodecyl sulfate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
3-4 نشاندارسازی DNA استخراج شده از کلون های BAC
در پژوهش حاضر نشاندار سازی پروب ها به صورت غیر مستقیم با استفاده از سیستم بیوتین (به عنوان هاپتن) و آویدین و روش Nick Translation (Biotin-Nick translation Mix Kit, Roche applied science Inc. Cat#1174582490) انجام شد. در روش Nick Translation آنزیم DNase I یک شکاف در 3/-OH توالی DNA مورد نظر ایجاد می کند. سپس یک یا چند نوکلئوتید در کنار شکاف ایجاد شده با فعالیت اگزونوکلئازی /3 به /5 آنزیم DNA-Polymerase I باکتری E.coli جداسازی می شوند. در مرحله بعد نوکلئوتیدهای جدا شده با نوکلئوتیدهای متصل شده به بیوتین به عنوان هاپتن توسط آنزیم اخیر جایگزین می شوند. تکرار واکنش های فوق باعث حرکت منطقه برش داده شده و نشاندار سازی رشته DNA تازه سنتز شده می شود (شکل 3-7). در پژوهش حاضر نشاندار سازی پروب ها طبق روش یانوزی و دی براردینو (2008) انجام شد.

3-5 تهیه کاریوتایپ گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز
پایه و اساس نقشه یابی فیزیکی ژن ها با تکنیک FISH آشنایی کامل با مرفولوژی کروموزوم ها و باندهای کروموزومی خاص هر کروموزوم است. در واقع توانایی تفکیک کروموزوم ها با توجه به الگوی باندینگ آن ها اساس تمامی پژوهش های سیتوژنتیک در همه موجودات را تشکیل می دهد. بر خلاف کروموزوم های انسان که از هفت گروه آتوزوم ها (A-G) و کروموزوم های جنسی تشکیل شده است و در آن انواع مختلف کروموزوم ها شامل متاسانتریک، ساب متاسانتریک، آکروسانتریک با طول های متفاوت یافت می شود که به تفکیک کروموزوم ها در کنار الگوی باندینگ آن ها کمک می کند، آتوزوم های گاوسانان همگی (به استثنا 3 و 5 آتوزوم به ترتیب در گوسفند و گاومیش) آکروسانتریک با کاهش طول نا محسوس هستند که فقط تفکیک آن ها از طریق کسب تجربه از راه الگوی باندینگ امکان پذیر است. به همین منظور قبل از وارد شدن به آزمایش FISH مدت زیادی صرف شناسایی و تفکیک کروموزوم های چهار گونه مورد مطالعه و تهیه کاریوتایپ آن ها شد. لازم به ذکر است که یک پژوهشگر سیتوژنتیک که در زمینه مکان یابی فیزیکی ژن ها کار می کند باید قادر به تفکیک راحت کروموزوم ها در متافاز گونه های مختلف باشد (در بخش 3-1-2 مواد و مراحل کشت سلول های خونی و تهیه اسلایدهای RB-باندینگ شرح داده شد).

3-6 هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH)
بعد از انتخاب اسلایدهای متافازی مناسب تهیه شده با روش R- باندینگ برای FISH و نشاندار سازی پروب های BAC، آزمایش FISH در پژوهش حاضر با روش واسرشته سازی همزمان (Co-denaturation) پروب و کروموزوم ها روی صفحه داغ (Hot plate) انجام شد. ابتدا اسلایدهای تهیه شده با روش RB- باندینگ در سری اتانول 70، 80 و 96 درصد هر کدام به مدت 5 دقیقه قرار داده شدند و بعد از خشکاندن در دمای اتاق با استفاده از Hoechst33258 رنگ آمیزی شده و همرا با بافر 2 برابر SSC به مدت 40 دقیقه در معرض اشعه فرابنفش (UV) تیمار شدند. در این فاصله نیز مخلوط واکنش به حجم 10 میکرولیتر حاوی 150-100 نانوگرم پروب نشاندار شده، 5/1 میکرولیتر Cot1 DNA گاوی و محلول واکنش هیبریداسیون تهیه شد. مخلوط هیبریداسیون به مدت 30 دقیقه در بن ماری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد که این مرحله را اصطلاحاً مرحله پیش اتصال (Pre annealing) می نامند که باعث اتصال Cot1 DNA با توالی های تکراری خاص گونه ای در پروب ها می شود و از این طریق سیگنال های ضمیمه در FISH کاهش خواهد یافت. پس از مشخص کردن ناحیه مورد نظر برای FISH روی اسلایدها، ابتدا اسلایدها به مدت 2 دقیقه در دمای 60 درجه سانتیگراد روی صفحه داغ یا روی دستگاه PCR قرار داده شدند (مرحله پیش واسرشته سازی (Re denaturation)) و سپس مخلوط واکنش در مرکز ناحیه مورد نظر ریخته شده و روی آن با لامل شیشه ای پوشانده شد. اسلاید به همراه مخلوط واکنش به طور همزمان به مدت 4 دقیقه در 75 درجه سانتیگراد روی صفحه داغ نگهداشته شدند و سپس در پارافیلم یا نایلون پیچیده شده و در جعبه مرطوب (Moist chamber) که قبلاً آماده شده بود قرار داده شدند و به مدت 3-1 روز در انکوباتر 5//37 درجه سانتیگراد برای انجام مرحله هیبریداسیون بین پروب و DNA کروموزوم قرار داده شدند. بعد از انجام FISH در همان روز محلول 1/0 برابر SSC تهیه شده و در سه جار کوپلین درون بن ماری در دمای60 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا در روز بعد در مرحله بعد از هیبریداسیون استفاده شود.

مطلب مشابه :  منابع و ماخذ پایان نامهکروموزوم، BMPR1B،، باندینگ

شکل 3-7. مراحل نشاندار سازی DNA با روش Nick Translation

3-7 مراحل بعد از FISH
پس از خارج سازی اسلایدها از انکوباتور، پارافیلم یا نایلون اطراف آن ها را باز کرده و به آرامی و با دقت لامل ها را جدا کردیم. باید دقت کرد که جدا سازی لامل ها با شدت و یا با کشش سبب پارگی متافازها خواهد شد. پس از جداسازی لامل ها، اسلایدها سه بار در محلول 1/0 برابر SSC هر کدام به مدت 5 دقیقه در 60 درجه سانتیگراد شستشو داده شدند.
3-7-1 آشکار سازی سیگنال های FITC
آشکار سازی سیگنال ها در پژوهش حاضر با استفاده از سیستم آنتی بادی های FITC-Avidin (Vector_A2011) و Anti-Avidin (Vector_A0300) انجام شد. پس از شستشوی اسلایدها در محلول 1/0 برابر SSC، در سه مرحله متوالی با ترتیب FITC-Avidin، Anti-Avidin و FITC-Avidin آن
تی بادی ها روی محل هیبریداسیون اضافه شده و در هر مرحله با یک قطعه پارافیلم پوشانده شده و در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شدند. بعد از هر بار خارج سازی از انکوباتور، پارافیلم ها را به آرامی جدا کرده و اسلایدها سه بار در بافر شستشو (PN- بافر) هر کدام به مدت 2 دقیقه روی شیکر شستشو داده شدند. استفاده متوالی از آنتی بادی ها در این روش باعث تکثیر و قوی تر شدن سیگنال های FITC خواهد شد. به این ترتیب که ابتدا FITC-Avidin به هاپتن بیوتن روی توالی DNA متصل می شود. سپس در گام دوم آنتی بادی Anti-Avidin اضافه می شود. Anti-Avidin ها به FITC-Avidin ها متصل می شوند و چون هر Anti-Avidin دارای چندین دنباله متصل شونده برای FITC-Avidin هستند، در مرحله سوم با اضافه کردن مجدد FITC-Avidin در واقع سیگنال های FITC تکثیر یافته و قوی تر می شوند (شکل 2-1).

3-7-2 RBPI- باندینگ
پس از مرحله آشکار سازی سیگنال ها، اسلایدها را در دمای انکوباتور خشک نموده و برای آشکارسازی باندهای کروموزومی با استفاده از پروپیدیوم آیوداید (PI) رنگ آمیزی شدند. مقدار µg/ml پروپیدیوم آیوداید را در محل هیبریداسیون روی اسلایدها ریخته و پس از پوشاندن آن با لامل شیشه ای بلند به مدت 10 دقیقه در محل تاریک در دمای اتاق قرار داده شدند. بعد از شستشو با آب دوبار استریل و خشک نمودن اسلایدها، یک قطره از محلول 1:1 PI:آنتی فید1 را به محل مورد نظر اضافه کرده و بعد از گذاشتن لامل شیشه ای بلند در جعبه تاریک تا زمان بررسی میکروسکوپی نگهداری شدند.

3-8 بررسی میکروسکوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC
در پژوهش حاضر بررسی میکوسکوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC و باندها RBPI زیر میکروسکوپ2 انجام شد. پس از جستجوی اسلایدها در محل هیبریداسیون و شناسایی یک متافاز خوب که دارای الگوی باندینگ و با تفکیک باندهای قابل قبول بود، با استفاده از فیلتی Texas Red از آن متافاز یک عکس تهیه و مجدداً همان متافاز برای مشاهده وجود سیگنال های مورد نظر با استفاده از فیلتر FITC مورد جستجو قرار گرفته و یک عکس نیز با فیلتر FITC از متافاز تهیه شد. بنابراین برای هر متافاز دو عکس (RBPI و FITC) تهیه می شد که بعداً با استفاده از نرم افزار فتوشاپ عکس ها روی هم قرار داده می شدند.

مطلب مشابه :  پایان نامه ارشد رایگان دربارهمکان یابی

3-9 تعیین محل دقیق (باند کروموزومی) ژن های مورد مطالعه روی کروموزوم ها
پس از تهیه عکس های RBPI- باندینگ و FITC، تعیین باندهای کروموزمی محل ژن های مورد نظر با استفاده از الگوی استاندارد نامگذاری کروموزوم های گاوسانان (CSKBB، 1994؛ یانوزی، 1994 و ISCNDB، 2000) انجام شد.

فصل چهارم

نتایج

4- نتایج
4-1 کیفیت DNA استخراج شده از کلون های BAC
پس از استخراج DNA از کلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر برای حصول اطمینان از روند استخراج و محاسبه غلظت نسبی، DNA استخراج شده همراه نشانگر وزن مولکولی (SM0331, Fermentase) و DNA فاژ لامبدا روی ژل آگارز 8/0 درصد الکتروفورز شدند. غلظت نسبی DNA استخراج شده نسبت به DNA فاژ لامبدا سنجیده شد (شکل 4-1).

4-2 نتایج حاصل از کشت سلولی و کاریوتایپ های تهیه شده برای گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با روش RBA- باندینگ
پس از انجام کشت سلولی به مدت 72 ساعت با استفاده از روش RB و پس از تهیه اسلایدها (به فصل سوم مراجعه شود)، از بین نمونه های کشت شده بهترین متافازها از نظر طول کروموزوم و باندینگ قابل تفکیک آن ها برای تهیه کاریوتایپ مورد استفاده قرار گرفتند.

4-2-1 کاریوتایپ RBA- باندینگ گاو (BTA)
کاریوتایپ گاو به عنوان کاریوتایپ مرجع برای تمامی گونه های گاوسانان استفاده می شود. متافاز و کاریوتایپ تهیه شده برای گاو در پژوهش حاضر در شکل 4-2 نشان داده شد. گاو اهلی گونه اروپایی (Bos taurus) (BTA, 2n=60) دارای 29 جفت آتوزوم آکروسانتریک و کروموزوم های X و Y ساب متاسانتریک است (شکل 4-3) (ISCNDB، 2000).

4-2-2 کاریوتایپ RBA- باندینگ گاو میش رودخانه ای (BBU)
کاریوتایپ تهیه شده برای گاو میش رودخانه ای در پژوهش حاضر در شکل 4-4 نشان داده شد. در متافاز گاو میش آسیایی تیپ رودخانه ای (BBU, 2N=50) 24 جفت آتوزوم دیده می شود که از بین آن ها پنج جفت اول (کروموزوم های 1 تا 5) ساب متاسانتریک و به ترتیب حاصل ترانسلوکاسیون روبرتسونی بین جفت کروموزوم های 27/1، 23/2، 19/8، 28/5 و 29/16 گونه های اجدادی گاوسانان هستند. کروموزوم های X و Y در گاو میش رودخانه ای آکروسانتریک هستند (شکل 4-5) (CSKBB، 1994؛ یانوزی، 1994 و ISCNDB، 2000).

4-2-3 کاریوتایپ RBA- باندینگ گوسفند (OAR)
گوسفند اهلی (OAR, 2n=54) دارای 26 جفت آتوزوم بوده و جفت های 1 تا 3 ساب متاسانتریک و به ترتیب حاصل ترانسلوکاسیون روبرتسونی کروموزوم های 3/1، 8/2 و 11/5 گونه های اجدادی گاوسانان هستند. کروموزوم X و Y در گوسفند به ترتیب آکروسانتریک و متاسانتریک هستند (شکل 4-6) (ISCNDB، 2000). متافاز و کاریوتایپ تهیه شده برای گوسفند در پژوهش حاضر در شکل 4-7 نشان داده شد.
4-2-4 کاریوتایپ RBA- باندینگ بز (CHI)
کاریوتایپ تهیه شده برای بز در پژوهش حاضر در شکل 4-8 نشان داده شد. کاریوتایپ بز اهلی (CHI, 2n=60) هم از نظر تعداد کروموزوم ها و هم از نظر الگوی باندینگ بسیار شبیه گاو است. تنها تفاوت موجود در متافازهای این دو حیوان در مورد آتوزوم های 9 و 14 و در مورد کروموزوم های جنسی مشاهده می شود. در متافاز بز یک ناحیه کوچک زیر سانترومری از کروموزوم 9 به ناحیه زیر سانترومری کروموز
وم 14 جابجا شده است. همچنین کروموزوم های X و Y در یز برخلاف گاو به ترتیب آکروسانتریک و متاسانتریک هستند (شکل 4-3) (ISCNDB، 2000).

4-3 جایگاه فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تکنیک FISH روی کروموزوم های RBPI- باندینگ گونه های مورد مطالعه
4-3-1 جایگاه فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو (BTA)
در پژوهش حاضر، ژن های بزرگ اثر BMPR1B، BMP15 و GDF9 (موثر بر باروری) برای اولین بار روی متافاز

Leave a Reply